Ge(001) before and after gold evaporation and annealing
Kernel of the 4-probe microscope (left), crushed tip on Si surface (middle), two STM tips over gold structures on Ge(001) surface

Mikroskopia sił atomowych AFM jako nowa metoda badawcza w ocenie inicjacji apoptozy w komórkach nowotworowych

Niniejszy projekt dotyczył ważnego, z punktu widzenia badań nad terapią nowotworową, zagadnienia apoptozy komórek nowotworowych wywołanej cząsteczką TRAIL/Apo2L (TNF-related apoptosis inducing ligand). Głównym celem zrealizowanym w tym projekcie było wyznaczenie siły  oddziaływania między cytokiną TRAIL/Apo2L a jej specyficznymi receptorami błonowymi komórek linii nowotworowych i normalnych oraz określenie zmian we właściwościach mechanicznych błony komórkowej podczas przebiegu procesu apoptozy. Zagadnienia poruszone w tym projekcie, oraz otrzymane rezultaty, są ważne z punktu widzenia rozwoju immunoterapii w leczeniu chorób nowotworowych.

 Należy podkreślić, iż w projekcie wykorzystano do badań ciągle nowatorską w dziedzinie badań biomedycznych technikę AFM. Korzystając z metod AFM można bezpośrednio scharakteryzować wiązanie między cytokiną a receptorem, wyznaczyć częstotliwość występowania wiązań (powinowactwo) i dodatkowo wyznaczyć rozkład aktywnych receptorów na powierzchni komórki.  Wykonane badania fluorescencyjne stanowiły doskonałe uzupełnienie badań AFM oraz pozwoliły na wykonanie pełnej interpretacji zaobserwowanych zmian głównie w kontekście  modyfikacji błony komórkowej oraz cytoszkieletu. 

Jako układ modelowy przyjęto układ w którym cytokina TRAIL osadzona jest na ostrzu natomiast na powierzchni osadzono wolne receptory. Eksperyment ten pozwolił na wyznaczenie wartości sił zerwania dla konkretnych receptorów, co stanowi poziom odniesienia w interpretacji wyników otrzymanych dla komórek. Następnie wykonano pomiary dla układu z komórkami, tj. ostrze AFM pokryte TRAIL, natomiast na powierzchni komórki wyhodowane na szkiełkach podstawowych. Przeprowadzone badania metodą spektroskopii sił AFM umożliwiło oszacowanie siły oddziaływania oraz prawdopodobieństwa adhezji TRAIL do receptorów błonowych. 

Ponieważ na powierzchni komórki znajduje się grupa receptorów wiążących specyficznie TRAIL, z czego tylko niektóre posiada tzw. domene śmierci umożliwiajaca indujcje sygnału apoptozy. W związku z tym w projekcie opracowano metodologie selektywnego blokowania receptorów umożliwiająca  określenie który receptor odpowiedzialny jest za wiązanie TRAIL. Pozwoliło to na stwierdzenie, iż w komórkach nowotworowych jest większa ekspresja receptorów z domena śmierci niż w komórkach nienowotworowych. Porównanie otrzymanych wartości z układem modelowym dodatkowo wzmocniło powyższa tezę oraz potwierdziło prawidłowość przyjętej metody selektywnego blokowania receptorów. 

Bardzo interesujący efekt zaobserwowano dla układu w którym zbadano oddziaływanie TRAIL z komórkami uprzednio inkubowanymi z chemioterapeutykiem (doxorubicyna, actinomycina). Komórki inkubowano z chemioterapeutykiem przez 12h a następnie wykonano pomiar metodą spektroskopii sił ostrzem pokrytym TRAIL. Badanie wykazało zdecydowany wzrost siły oddziaływania oraz prawdopodobieństwa adhezji dla tego ukłądu. Na tej podstawie można stwierdzić, iż chemioterapeutyki podnoszą zdolność receptorów do wiązania TRAIL w komórkach nowotworowych. Co ważne podobnego wzmocnienia oddziaływania nie zaobserwowano dla komórek nienowotworowych.

Przeprowadzona charakterystyka wiązania cytokiny z receptorami poprzez tzw. pomiary dynamiczne (loadin rate) wykazała, iż wiązanie miedzy TRAIL a receptorami błonowymi komórki nie jest stabilne. Natomiast jeżeli komórki inkubowane są z chemioterapeutykiem, wówczas stała dysocjacji maleje, a tym samym wiązanie staje się bardziej stabilne. Badania dynamiczne doskonale potwierdziły pomiary statyczne wiązania TRAIL z receptorami komórek, jednocześnie dostarczając pełnej charakterystyki tego oddziaływania. Należy podkreślić ważny efekt pomiarów, obie metody wskazują na zwiększenie powinowactwa TRAIL do receptorów komórek nowotworowych po uprzednim działaniu na komórki chemioterapeutykiem. Można postawić ważny wniosek, iż zastosowane chemioterapeutyki uwrażliwiają komórki nowotworowe na działanie TRAIL. 

W pierwszej części realizacji projektu skupiono się na charakterystyce samego oddziaływania TRAIL z komórkami nowotworowymi, w kolejnych etapach realizacji projektu skupiono się na efekcie jaki wywołuje TRAIL działając na komórki. W tym celu wykonano pomiary sztywności komórek metodą nanoindentacji ostrzem AFM, morfologii powierzchni komórki (AFM), oraz zastosowano metody mikroskopii fluorescencyjnej (barwienie białek cytoszkieletu, oznaczanie komórek apoptotycznych). Badania wykonano dla różnych czasów inkubacji z TRAIL, tj. 1h, 3h, 12h, 24h, 36h, 48h.

Otrzymane wyniki pomiaru właściwości mechanicznych wskazują na zależny od czasu inkubacji wzrost sztywności (spadek elastyczności) komórek nowotworowych inkubowanych z TRAIL. Wzrost sztywności komórki jest związany z reorganizacją cytoszkieltu aktynowego i tworzeniem tzw. włókien naprężeniowych. Potwierdzają to wykonane zdjęcia fluorescencyjne z barwieniem F-aktyny (AlexaFluo 488). Wykonane zdjęcia AFM morfologii komórek pokazały, iż wraz z czasem inkubacji wzrasta pofałdowanie błony, oraz zmniejszenie się wysokości komórek. Z kolei barwienie markerami apoptozy: AnnexinV i MitoCapture wykazały dla komórek inkubowanych z TRAIL przez 36h i 48h  wzrost liczby komórek we wczesnej fazie apoptozy o 10% w stosunku do kontroli. Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, iż działanie TRAIL polega głownie na reorganizacji cytoszieletu w kierunku tworzenia się włókien naprężeniowych oraz zwiększenia sztywności komórki. Otrzymane wyniki wskazują na odporność badanych komórek nowotworowych na działanie TRAIL, polegające na wyzwoleniu w komórkach nowotworowych czynników blokujących apoptoza. 

Wzmocniony efekt indukcji procesu apoptozy zaobserwoano dla komórek inkubowanych z TRAIL i chemioterapeutykami. W tym przypadku w skutek działania chemioterapeutyka następuje odblokowanie procesów komórkowych prowadzących do apoptozy. Co więcej analiza zmian sztywności komórek poddanych działaniu kombinacji TRAIL+ chemioterapeutyk oraz każdego z tych czynników osobno wykazała różna drogę  przebiegu apoptozy dla kombinacji związków i dla samego chemioterapeutyki. Ważny z punktu widzenia terapii nowotworowej jest fakt, iż oba czynniki zostały zastosowane w małych dawkach, co oznacza, iż współdziałanie TRAIL z chemioterapełtykami może spowodowac obniżenie dawki

Targosz-Korecka, M., Biedron, R., Szczygiel, A. M., Brzezinka, G., Szczerbinski, J., & Zuk, A. (2012). Stiffness changes of tumor HEp2 cells correlates with the inhibition and release of TRAIL-induced apoptosis pathways. Journal of molecular recognition : JMR, 25(5), 299–308. doi:10.1002/jmr.2192

joomla template 1.6